Abstract
Mollusken (o.a. slakken) maken deel uit van de enorm grote groep van
invertebraten. De vroege ontwikkeling van de mollusk Patella vulgata is bestudeerd
als modelsysteem voor de mollusken. De vroege ontwikkeling van deze zeeslakken
kenmerkt zich door enerzijds de manier van klieven, namelijk spiraalklieving, en
anderzijds door de vorming van een larvaal stadium, de
... read more
trochophora larve. De
trochophora beweegt zich voort met behulp van een geciliëerde band met cellen,
genaamd de prototrooch. De eerste cellen worden al zeer vroeg in de ontwikkeling
gevormd tijdens de vierde klieving waardoor een 16-cellig embryo ontstaat. Vier cellen
zullen differentiëren (zich ontwikkelen) tot primaire trochoblasten, die nog twee maal
delen en daarna ciliën gaan vormen. In dit onderzoek is gekeken naar hoe deze cellen
weten dat ze trochoblastcel zijn, met name welke factoren hiervoor bepalend zijn.
Al sinds 1900 wordt gedacht dat deze factoren door de moederslak in de eicel
worden geplaatst, vandaar de naam maternele factoren, en door de delingen specifiek
in de trochoblast cellen terecht komen. Dit proces hebben wij op een moleculair niveau
bestudeerd. De trochoblast cellen brengen als enige cellen vanaf het 32-cellig stadium
een tubuline gen tot expressie, wat leidt tot de aanmaak van tubuline eiwit dat nodig is
voor de ciliën. De regulatie van dit tubuline gen is bestudeerd op het niveau van
transcriptie, het overschrijven van het DNA op het chromosoom wat leidt tot de
aanmaak van een boodschapper molecuul (mRNA) dat later vertaald wordt in een
eiwit. Verschillende factoren zijn noodzakelijk voor deze transcriptionele regulatie,
namelijk specifieke stukken in het gen, de ‘cis-acting’ elementen, en ‘trans-acting’
factoren die daar aan kunnen binden, ook transcriptiefactoren genaamd. Voor de
regulatie van het tubuline gen zijn twee cis-acting elementen onmisbaar, é é n element
waar een remmende factor aan kan binden en é é n element waaraan een activerende
factor bindt. In hoofdstuk 3 zijn de resultaten van de zoektocht naar de ‘trans-acting’
factoren die aan deze ‘cis-acting’ elementen binden beschreven. Met een
‘Southwestern assay’, waarin de binding van eiwitten aan stukjes DNA kan worden
bestudeerd, is vastgesteld dat de activerende factor waarschijnlijk een klein eiwitje met
een molecuulgewicht dat kleiner is dan 20 kDalton. Andere eiwitten die ook aan de
belangrijkste ‘cis-acting’ elementen binden met molecuulgewichten van 42 and 55
kDalton werden tevens gevonden. Verder tonen ‘gel shift’ experimenten aan dat er
verschillende factoren binden aan de belangrijkste ‘cis-acting’ elementen op
verschillende tijdstippen van de ontwikkeling van de larve, wat zou kunnen betekenen
dat er verschillende factoren nodig zijn voor het aanschakelen van het tubuline gen
tijdens de vroege ontwikkeling en voor het onderhoud van de tubuline expressie later. We hebben geprobeerd om deze factoren met verschillende methoden uit embryos te
zuiveren, maar dat is niet gelukt. Met behulp van ‘Cytochalasine B’ experimenten is
verder bepaald dat de factoren nodig voor tubuline expressie in de trochoblast cellen al
aanwezig zijn in de moedercellen van de trochoblasten op het 8-cellig stadium, de
micromeren, en niet in de overige cellen, de macromeren. Tevens is de correcte
vorming van de micromeren en de macromeren tijdens de derde klieving, namelijk de
vorming van een animale laag (aan de ‘bovenkant’) van vier micromeren bovenop vier
macromeren aan de vegetatieve kant (‘onderkant’) van het embryo, noodzakelijk voor
correcte tubuline expressie (hoofdstuk 2).
Een tweede strategie om de maternele factoren die door de moederslak in het
embryo geplaatst worden en die van belang zijn voor het bepalen van de identiteit van
een cel, te isoleren was de uitvoering van een ‘differential display’. Er is gekeken naar
verschillen in boodschapper moleculen (mRNA’s) tussen de micromeren en
macromeren, die coderen voor factoren die de ontwikkeling gaan bepalen. Dit heeft de
isolatie van drie interessante eiwitten opgeleverd. Het eerste is glutaredoxin (mi9), een
eiwitje dat andere eiwitten kan modificeren door een redox reactie, een chemische
reactie door uitwisseling van zuurstof atomen (hoofdstuk 5). Dit eiwitje kan mogelijk
transcriptiefactoren die de ontwikkeling van een cel bepalen modificeren en als
zodanig de ontwikkeling van bepaalde cellen beïnvloeden. Verder is een
transcriptiefactor geïsoleerd, mi10, die de transcriptie van verschillende genen kan
reguleren (hoofdstuk 6). Tenslotte Esther32 (E32), een RNA-bindend eiwit, wat de
aanmaak van bepaalde eiwitten kan beïnvloeden (hoofdstuk 7). Het mRNA voor dit
eiwit komt specifiek in bepaalde cellen voor, die gekenmerkt worden door het feit dat
ze nog delen. Niet delende cellen die al gedifferentiëerd zijn, zoals de trochoblasten in
de prototrooch hebben E32 mRNA niet. Dit suggereert dat E32 een rol speelt bij het
bepalen wanneer een cel stopt met delen en gaat differentiëren. De precieze rol van
deze eiwitten tijdens de vroege ontwikkeling van Patella vulgata moet verder
onderzocht worden.
Verder is er gekeken of het mechanisme dat de trochoblasten in Patella embryos
gebruiken voor hun differentiatie ook voor komt bij andere diersoorten die ook een
spiraalklieving hebben (hoofdstuk 4). Eerst is gekeken naar andere slakken (van het
fylum Mollusca), namelijk de soorten Dentalium en Acantochiton. Deze slakken
brengen het tubuline gen van Patella ook specifiek in de trochoblast cellen tot
expressie, waaruit kan worden afgeleid dat de factoren nodig voor de expressie van het
tubuline gen aanwezig zijn in deze slakken en dat deze slakken waarschijnlijk
hetzelfde mechanisme gebruiken voor de expressie van hun eigen tubuline in de
trochoblast cellen. Dit zou betekenen dat dit mechanisme voor trochoblast specifieke
tubuline expressie evolutionair geconserveerd is in de mollusken en daarom al
waarschijnlijk aanwezig was in de voorouder van de slakken. Er is ook gekeken naar
andere soorten, namelijk de ‘polychaete’ ringwormen Platynereis, Nereis en
Chaetopterus (fylum Annelida), de ‘ribbon’ worm Cerebratulus en de platworm
Hoploplana. Van deze wormen brachten é é n embryo van de ringworm Platynereis en meerdere embryos van de ‘ribbon’worm Cerebratulus het Patella tubuline tot
expressie. Omdat in de laatste embryos het tubuline gen niet specifiek in de
trochoblasten tot expressie werd gebracht, is het nog niet geheel duidelijk of het
mechanisme voor trochoblast specifieke tubuline expressie ook buiten het fylum
Mollusca geconserveerd is.
De experimenten beschreven in dit proefschrift geven aanleiding tot nadenken
over de manier waarop cellen tijdens de vroege embryogenese van de mollusc Patella
vulgata gespecificeerd worden. Ondanks dat er sterke aanwijzingen zijn dat de
trochoblasten gespecificeerd worden door de aanwezigheid van gelocaliseerde
maternele factoren, is het niet gelukt om differentiëel gedistribueerde factoren te
isoleren. In tegenstelling tot de differentiële distributie van mRNA’s die coderen voor
factoren betrokken bij determinatieprocessen in andere soorten zoals de fruitvlieg
Drosophila, zijn er in Patella geen differentiëel gedistribueerde mRNA’s gevonden op
het 8-cellig stadium. Wel zijn er aanwijzingen gevonden dat door middel van
mechanismen op het niveau van de vertalen van mRNA’s (translatie) en
eiwitmodificatie (post-translationele modificatie) een differentiële activiteit van
determinerende factoren verkregen kan worden. Esther 32 is een RNA-bindend eiwit
en zou de translatie van bepaalde voor specificatie belangrijke mRNA’s kunnen
beïnvloeden. Glutaredoxin kan eiwitten, waaronder mogelijk transcriptiefactoren, post-translationeel
modificeren en de activiteit van mi10, een transcriptiefactor, wordt
mogelijk gereguleerd door fosforylatie.
show less